التحقق من مكمل DNA العكسي: العودة والمواضع ونسبة GC

حدد حروف المعطى واتجاه طرفيه

التحقق من المكمل العكسي باختبار مواضع القواعد يميز النتيجة الصحيحة من عمليات تشبهها في اختبارات مختصرة. نؤلف تسلسلًا من ثلاثة عشر موضعًا، ونقارن المكمل العكسي بإبقاء التسلسل كما هو، وقلب ترتيبه فقط، واستبدال كل قاعدة بمكملتها فقط. ستعيد العمليات الأربع التسلسل الأصلي إذا كررنا كل واحدة مرتين، وستحفظ عدد مواضع السيتوسين والجوانين معًا. ومع ذلك لن تحقق كلها شرط مقابلة القواعد واتجاه طرفي الشريط. ثم نختبر تسلسلًا مؤلفًا آخر يعود مكمله العكسي مطابقًا له، كي نفهم لماذا لا يكفي طلب ناتج مختلف عن المدخل. الأمثلة والرسومان من إعدادنا، ولا ننسب الحروف إلى جين محدد أو عينة شخص.

تمثل الحروف الأربعة قواعد DNA المعتادة: الأدينين والثايمين والجوانين والسيتوسين. في المقابلة المعتادة عبر الشريطين تكون أزواج الأدينين والثايمين، والجوانين والسيتوسين. [1]

نستعمل في هذه الورقة الحروف اللاتينية الكبيرة الأربعة فقط، ونفصل علامات الطرفين من نص التسلسل الذي نعد مواضعه. الطول ثلاثة عشر يخص أحرف القواعد، ولا يضم الرقم خمسة أو ثلاثة أو الشرطة التي نضعها لعرض الطرف. لا نعالج رموزًا أخرى أو موضعًا مجهول القاعدة في هذا النموذج؛ إذا احتوى مدخل مختلف على رموز إضافية، يحتاج تعريف مقابلة مناسبًا قبل تعميم نتيجة هذا الفحص عليه.

ونعلن اتجاه كتابة المعطى من خمسة إلى ثلاثة قبل أي عملية. تسمية الطرفين ليست عدد قواعد أو ترتيب خطوات في تجربة؛ إنها جزء من وصف الشريط الذي نعرضه. لن نكتفي بنص من الحروف ثم نستنتج اتجاهه من شكله. كل النتائج في جدول المقارنة اللاحق تقدم على أنها كتابات مستقلة تبدأ بخمسة وتنتهي بثلاثة، وهذا الشرط هو ما سيجعل بعض الإجراءات غير صحيحة للمطلوب المحدد.

s = 5′-AAGTCGATACCAT-3′; n = 13; alphabet = {A,C,G,T}

اكتب المقابل مع الحفاظ على اتجاهه

يعبر طرفا خمسة وثلاثة عن جهتين في سلسلة النيوكليوتيدات؛ في الشريطين المتقابلين يكون طرف ثلاثة من أحدهما مقابل طرف خمسة من الآخر. لذلك لا يحمل سطران مصطفان للمقابلة اتجاه القراءة نفسه. [2]

نكتب مقابل كل موضع من المعطى قاعدته المكملة من غير تغيير ترتيب الأعمدة في الرسم. الأدينين الأول يقابله ثايمين، والأدينين الثاني ثايمين، والجوانين الثالث سيتوسين، وتتابع القاعدة نفسها إلى آخر موضع. الناتج المصطف تحت المعطى هو TTCAGCTATGGTA، لكن طرفه الأيسر ثلاثة والأيمن خمسة. لا نبدل اسمي الطرفين لكي يتفقا شكليًا مع المعطى، لأن ذلك سيغير الوصف الذي جعل كل عمود زوجًا متقابلًا.

الخطوط الرأسية في الرسم تصل مواضع نقارنها وفق هذا النموذج، ولا تحصي عدد الروابط الهيدروجينية أو تصور أبعاد لولب فعلي. كذلك لا نستخرج من الحروف اسم جين أو وظيفة بيولوجية معينة. أعددنا سلسلة قصيرة للتفسير والتحقق من ترتيبها وحدودها؛ ليس وجود نمط مألوف في بعض حروفها دليلًا على أننا قدمنا سجلًا وراثيًا أو موقعًا معروفًا في عينة.

5′-AAGTCGATACCAT-3′ 3′-TTCAGCTATGGTA-5′

أعد كتابة المقابل بدءًا من خمسة

إذا أردنا عرض الشريط المقابل وحده من خمسة إلى ثلاثة، يبدأ النظر من طرفه الأيمن في الرسم السابق. نقرأ الحروف من هناك باتجاه طرفه الأيسر: أدينين ثم ثايمين ثم جوانينان، ونكمل حتى آخر ثايمينين. الكتابة الناتجة ATGGTATCGACTT. تغيرت طريقة عرض الشريط المقابل الذي أعددناه، ولم نستبدل قواعده بعد ذلك بمعنى عملية كيميائية إضافية؛ قلبنا ترتيب الحروف في النص كي يطابق بداية القراءة المعلنة.

يمكن تفكيك العملية النصية إلى استبدال القاعدة بمكملتها ثم قلب ترتيب النص، أو إلى قلب ترتيب المعطى ثم استبدال كل حرف بمكمله. يتفق الطريقان في نموذجنا لأن الاستبدال يعمل على كل حرف مستقلًا عن مكانه. سنرمز للمقابلة بحرف وللقلب بحرف آخر، ولجمعهما بالمكمل العكسي. التعريف يتعلق بالحروف الأربعة واتجاهي العرض اللذين ثبتناهما، ولا يحتاج بيانات عن سرعة بناء شريط في خلية.

أما تقديم TTCAGCTATGGTA على أنها كتابة الشريط المقابل من خمسة إلى ثلاثة، فليس النتيجة التي استخرجناها لهذا المعطى. هذه الحروف تصلح للمقابلة العمودية عندما تبدأ بثلاثة في الرسم، لكن إبقاء ترتيبها مع تغيير الطرفين يصف نصًا مختلفًا. لا نقرر الخطأ من كون الحروف غير مسموحة؛ جميعها من المجموعة نفسها. نراجعه من نوع العملية وطرف البداية الذي طلبناه لهذه الكتابة المستقلة.

C(s) = TTCAGCTATGGTA; R(C(s)) = C(R(s)) = ATGGTATCGACTT

موضع المعطى الأول يقابل موضع الناتج الأخير

نرقم المعطى من واحد إلى ثلاثة عشر في اتجاه كتابته، ونرقم الناتج المستقل بالطريقة نفسها من خمسة إلى ثلاثة. عند الاصطفاف الجسدي المتعاكس يتقابل الموضع الأول من المعطى مع الثالث عشر في كتابة المكمل العكسي، والثاني مع الثاني عشر، وهكذا. المقارنة الصحيحة ليست حرف المدخل الأول مع حرف الناتج الأول؛ فهما من طرفين لا يقعان متقابلين في هذا العرض.

في مثالنا الحرف الأول من المعطى أدينين والحرف الأخير من الناتج ثايمين، فيوافق شرط المقابلة. أما أول حرف في الناتج فهو أدينين، لذلك المقارنة من اليسار إلى اليسار بين أول حرفين ستعطي أدينين مع أدينين، وتوحي بخطأ لم يحدث في النتيجة الصحيحة. حافظ على علاقة الفهرسين مع إعلان اتجاه الطرفين؛ اختيار الحرف الصحيح وحده لا يصلح فحصًا ربط موضعين مختلفين.

للطول ثلاثة عشر يكون موضع الناتج المقابل لموضع المعطى أربعة عشر ناقص رقم موضع المعطى. نراجع القاعدة لجميع المواضع، لا لأول زوج فقط. وإذا كان طول مختلف معلومًا، تصبح العلاقة الطول زائد واحد ناقص الموضع. هذه طريقة حسابية لفحص كتابة مستقلة معروفة الاتجاه، وليست تعريفًا عامًا لأي صورة لسطرين دون أطراف؛ إذا تغير عرض السطر أو اتجاهه، نعيد تحديد علاقة مواضعه أولًا.

q[14−i] = complement(s[i]), i=1,…,13 (one-based positions)

العودة بعد مرتين شرط لا يحدد العملية

المكمل العكسي الصحيح يعود إلى المعطى بعد تطبيقه مرتين في الحروف الأربعة التي اخترناها. المقابلة الثانية تعيد كل قاعدة إلى أصلها، وقلب الترتيب الثاني يعيد مواضعها. نستطيع التأكد على المعطى الثلاثي عشر: نحسب مكمل ATGGTATCGACTT العكسي فترجع AAGTCGATACCAT. هذا تحقق مفيد لعلاقة العملية بنفسها، لكنه لا يقارن وحده الناتج الأول بالمعنى الذي أردناه منه.

القلب فقط يعود إلى الأصل بعد مرتين أيضًا؛ إذا قرأنا النص من نهايته ثم قلبناه ثانية استعدنا ترتيب البداية. والمقابلة فقط تعود إلى الأصل لأن الأدينين والثايمين يتبادلان مرتين، وكذلك الجوانين والسيتوسين. وحتى إجراء الإبقاء الذي يعيد النص كما استلمه ينجح في اختبار العودة بعد مرتين. إذن يمكن لأربع عمليات مختلفة أن تحقق هذا الشرط، فلا يكشف الاختبار وحده أي واحدة استعملت.

هذا لا يفسد فائدة اختبار العودة، بل يحدد ما أثبته. إذا فشل فقد كشف عدم توافق مع الخاصية التي يتوقعها نموذجنا، وإذا نجح فلا تزال هناك إجراءات غير مطابقة للمطلوب قد نجحت أيضًا. نضيف اختبار مواضع القواعد المقابلة باتجاهيهما، ونقارن الناتج المتوقع للمعطى المؤلف. تسجيل اسم الخاصية التي اختبرناها يمنع تحويل نجاح واحد إلى تقرير بأن كل تعريف للعملية تحقق.

RC(RC(s))=s; R(R(s))=s; C(C(s))=s; I(I(s))=s

عدد GC يحفظ التركيب ويترك سؤال المواضع

في المعطى خمسة مواضع أدينين، وثلاثة ثايمين، وثلاثة سيتوسين، وموضعا جوانين. مجموع الجوانين والسيتوسين خمسة من ثلاثة عشر، أي نسبة تقارب ثمانية وثلاثين وستة وأربعين جزءًا من مئة بالمئة. القلب لا يغير عدد أي حرف، والمقابلة تبدل أعداد الجوانين والسيتوسين بينهما فيبقى مجموعهما. لذلك تبقى هذه النسبة في نتائج المكمل العكسي والقلب والمقابلة والإبقاء على السواء.

وقد نراجع أعداد الحروف الأربعة بدل نسبة واحدة: نتوقع في المكمل العكسي ثلاثة أدينين وخمسة ثايمين وثلاثة جوانين وسيتوسينين. لكن إجراء المقابلة وحدها يعطي الأعداد المتوقعة نفسها في مثالنا، مع ترتيب لا يوافق كتابة المكمل من خمسة إلى ثلاثة. العد الكامل يضيف معلومات عن التركيب، لكنه لا يحدد موقع كل حرف. لا نعطي نتيجة اختبار الأعداد وظيفة لم يختبرها، وهي ترتيب القواعد مع اتجاه الشريط المطلوب.

وتظهر النسبة في تمريننا كفحص عدد حروف، وليست قياسًا مختبريًا أو استنتاجًا عن الكائن أو الجين الذي تنتمي إليه عينة. الأرقام تصف مقطعًا ألفناه. كما لا نكتفي بأن الناتج احتوى الأحرف الأربعة وبقي طوله ثلاثة عشر؛ كل هذه الصفات يمكن أن تظهر في ترتيب خاطئ. نحتفظ بها لفحص الشكل والتركيب، ثم نحتاج علاقة كل موضع لكي نقول إن السطر هو المكمل العكسي المحدد للمعطى.

counts(s): A=5,T=3,C=3,G=2; GC=5/13≈38.46%; counts(RC(s)): A=3,T=5,C=2,G=3

أربع نتائج على معيار موضعي واحد

نضع أمام المعطى النتائج الأربع على أنها كتابات مستقلة من خمسة إلى ثلاثة. المكمل العكسي ATGGTATCGACTT يحقق المقابلة عند جميع المواضع الثلاثة عشر وفق الفهرس المعاكس. الإبقاء يعطي AAGTCGATACCAT ويوافق أربعة مواضع فقط، والقلب وحده يعطي TACCATAGCTGAA ويوافق صفرًا. والمقابلة وحدها تعطي TTCAGCTATGGTA وتوافق ثلاثة مواضع. حسبنا المواضع بالقاعدة نفسها في كل صف كي لا نقارن إجراءً بمعيار مختلف عن الآخر.

إن تطابق بعض مواضع الإبقاء لا يجعله شريطًا مكملًا صحيحًا كله. في هذا المثال يوافق الزوج الأول والأخير وأزواج أخرى، لكن الفحص الكامل لا يصل إلى ثلاثة عشر. ولذلك لا يكفي انتقاء زوج طرفي نجح لتمرير باقي السطر. ويمكن تفسير فشل القلب فقط في جميع المواضع: عند إعادة فهرسه إلى موضع المعطى يعيد الحرف نفسه، ولا تتقابل أي قاعدة من الأحرف الأربعة مع نفسها في قاعدة المقابلة التي حددناها.

المعيار الكامل يحدد الناتج حرفًا حرفًا. إذا ثبت طول المعطى، واتجاه كتابة الطرفين، وخريطة المقابلة المختارة، فلا توجد حرية في اختيار حرف آخر عند الموضع المقابل. إذن فحص جميع العلاقات الموضعية أقرب إلى التعريف الذي نريده من مقارنة النسبة أو خاصية العودة وحدهما. لا نختبر هنا خوارزمية برنامج خارجي أو نقارن أدوات تجارية؛ الإجراءات الحسابية الأربع من إعدادنا لإظهار الفرق بين خواص لازمة وتعريف كامل للنتيجة.

opposite-index matches: RC=13/13; identity=4/13; reverse=0/13; complement=3/13

التسلسل المتناظر يكشف اختبارًا آخر غير كافٍ

نؤلف تسلسلًا ثانيًا من ثمانية مواضع هو AACGCGTT. مقارنته بقاعدة المكمل العكسي تعيد التسلسل نفسه؛ أوله يقابل آخره بالمقابلة المعتادة، والثاني يقابل السابع، والثالث يقابل السادس، والرابع يقابل الخامس. لا نحتاج أن يكون الناتج مختلفًا عن المدخل في كل حالة. هذه خاصية للتسلسل المختار في نموذج الحروف والاتجاه، ولا نستنتج منها بنية مطوية أو سلوكًا تجريبيًا أو وظيفة جينية.

ولو اختبرنا إجراء الإبقاء بهذا التسلسل فقط، لأعطى الجواب المتوقع في هذه الحالة، لأنه أعاد النص الذي يساوي مكمله العكسي. لذلك نضيف إلى اختباراتنا معطى آخر غير متناظر، مثل التسلسل الثلاثي عشر الذي بدأنا به. لا نلغي المثال المتناظر؛ له فائدة في مراجعة الخواص، لكننا نعرف لماذا لا يكفي وحده لكشف إجراء يعيد كل مدخل بلا تغيير. اختلاف صفات أمثلة الاختبار يمنع نجاحًا محدودًا من إخفاء نقص العملية.

وفي الحروف الأربعة التي نعالجها لا يمكن لتسلسل فردي الطول أن يساوي مكمله العكسي؛ سيقابل موضعه الأوسط نفسه، فيحتاج قاعدة مكملة لذاتها وفق خريطتنا، ولا توجد واحدة منها كذلك. يفسر هذا لماذا لا يكون معطانا ذو الثلاثة عشر مثالًا متناظرًا من هذا النوع. الكلام عن تسلسل ذي رموز أخرى يتطلب قواعد مقابلة أخرى قبل نقل هذا الاستنتاج إليه، فلا نجعله حكمًا شاملًا على كل اصطلاح لترميز بيانات حيوية.

RC(AACGCGTT)=AACGCGTT; RC(AAGTCGATACCAT)≠AAGTCGATACCAT

إذا تغير اتجاه المعطى فتغير المطلوب الحسابي

نكتب الشريط الأصلي نفسه باتجاه العرض المعاكس: ثلاثة يسارًا وخمسة يمينًا، ونص حروفه TACCATAGCTGAA. إذا طلبنا الآن مقابله مكتوبًا من خمسة إلى ثلاثة، فاستبدال كل حرف بمكمله على هذا السطر يعطي ATGGTATCGACTT مباشرة. لم نثبت أن المقابلة وحدها صارت مكملًا عكسيًا صحيحًا لأي مدخل؛ تغير اتجاه المعطى الذي أعطي للتمرين، فصارت المطابقة على الصفحة تتبع شروطًا أخرى.

لهذا كان جدول الإجراءات السابق مقيدًا بأن معطاه ونتائجه تكتب مستقلة من خمسة إلى ثلاثة. إذا أخذنا سطرًا يبدأ بثلاثة ثم طبقنا عليه اختبارًا صيغ لمدخل يبدأ بخمسة من غير تحويله، فقد نرفض جوابًا مناسبًا للسؤال الجديد أو نقبل وصفًا خاطئًا له. ليست تسمية الطرفين تعليقًا يمكن نزعه من النص أثناء المراجعة. نحتفظ باتجاه المدخل واتجاه المخرج المطلوب مع الحروف عند نقل الحالة إلى ورقة أو برنامج.

ولا ننقل العملية إلى RNA بتبديل حرف الثايمين باليوراسيل من غير تحديد نوع السلسلة والمطلوب. تلك مسألة لها خريطة ونوع حروف وسياق مختلف، لم نضعها في اختبارات هذا المقال. كانت الأمثلة عن DNA بأحرفه الأربعة المعتادة وعلى شريط مكتوب معلوم الاتجاه. حدود السؤال هي ما يجعل المصطلح والتحقق واضحين؛ إذا تغيرت نعيد تعريف العملية بدل استعمال اسم مألوف على كل سلسلة حروف.

3′-TACCATAGCTGAA-5′ → complementary 5′-ATGGTATCGACTT-3′

ثلاثة عشر زوجًا وستة وعشرون نيوكليوتيدًا

في نموذج سطرَي المقابلة الأصليين يكون لكل موضع من المعطى موضع مقابل في الشريط الآخر، فتوجد ثلاثة عشر زوجًا قاعديًا. كل زوج يجمع قاعدتين في نيوكليوتيدين من الشريطين، فيكون العدد في مجموعهما ستة وعشرين. لا نسمي طول كل شريط ستة وعشرين لمجرد أننا رسمنا السطرين، ولا نختصر الزوج إلى قاعدة واحدة عندما نعد ما يوجد في الشكلين معًا.

يظهر من عد معطينا ومقابله أن الأدينين والثايمين في مجموع الشريطين ثمانية لكل منهما، والجوانين والسيتوسين خمسة لكل منهما. أما المعطى وحده فالأدينين فيه خمسة والثايمين ثلاثة، والجوانين اثنان والسيتوسين ثلاثة. تساوي المجموع عبر الزوج المتكامل لا يفرض أن تتساوى أعداد كل زوج من الحروف داخل شريط واحد منفرد. نكتب مجال العد قبل نقل مساواة وجدناها في مجموع السطرين إلى أحدهما.

وتظل نسبة الجوانين والسيتوسين معًا خمسة من ثلاثة عشر في الشريط المختار، وعشرة من ستة وعشرين في مجموع الشريطين؛ الكسرتان متساويتان. هذه مراجعة عددية لمقطعنا، وتوضح مرة أخرى أن النسبة لا تكشف ترتيب كل قاعدة. كذلك لا نحول خطوط المقابلة الثلاثة عشر في الرسم إلى ثلاث عشرة رابطة هيدروجينية، لأن الخط في هذا المخطط يمثل موضعًا مقابلًا لا جردًا تفصيليًا للروابط الكيميائية في بنية كاملة.

الرسم يعلن معنى كل صف وعمود

يعرض الرسم الأول المعطى والمقابل المصطف له بأطرافهما المتعاكسة، ثم كتابة المقابل وحده تبدأ بخمسة. ترقيم المعطى يتقدم من واحد إلى ثلاثة عشر، وترقيم المواضع الأصلية في الصف المستقل يساعد على قراءة الطرف الآخر. لا ننظر إلى موضع الحرف الأول في كل صف على الصفحة ونفترض أنه يقابل ما فوقه في كل أنواع العرض؛ الأطراف والعنوان يحددان ما الذي تمثله تلك المحاذاة.

أما الرسم الثاني فيضع الإجراءات الأربعة في جدول، مع سطر الناتج ونجاح العودة بعد مرتين وعد مواضع الجوانين والسيتوسين وعد المقابلات الصحيحة بالفهرس المعاكس. لا تعني نعم في عمود العودة أن بقية الأعمدة أثبتت العملية الصحيحة. الفروق في عمود المواضع هي ما يراجع شرط المكمل في هذا المثال، بينما تكشف الأعمدة المتشابهة حدود الاعتماد عليها وحدها.

الألوان في الرسم للقراءة وتتبع القواعد، وليست قياسات لخاصية كيميائية أو نتيجة من جهاز تسلسل. نستعملها مع الحروف والأطراف والأعداد حتى يمكن مراجعة النتيجة دون الاعتماد على اللون وحده. إذا أعدت كتابة الحالة بلا رسم، فاحتفظ بهذه المعلومات في النص. صورة مريحة للعين لا تصلح بديلًا عن تسمية الاتجاه والمعيار، كما أن عددًا صحيحًا في جدول لا يثبت موضعًا لم نختبره.

بطاقة تحقق تتبع التعريف

ابدأ البطاقة بتحديد نوع الحروف واتجاه المعطى واتجاه الناتج المطلوب. افحص الطول والحروف المسموحة، ثم عد التركيب إذا كان مفيدًا، وسجل خاصية العودة بعد مرتين بوصفها اختبارًا محددًا. بعد ذلك راجع كل قاعدة مع موضعها المقابل من الطرف الآخر وفق علاقة الفهرسين التي كتبتها. هذه الخطوة تصل الفحص بالمعنى الذي تريد التحقق منه بدل جمع نتائج عامة وتسمية مجموعها صحة.

واستعمل حالة غير متناظرة وأخرى متناظرة مكملًا عكسيًا كي تعرف ما يكشفه كل مثال. عودة الأصل أو بقاء الناتج مساويًا للمدخل قد يكونان صحيحين في حالات، لكنهما لا يفرضان النتيجة الصحيحة لكل مدخل. في معطانا الأول اختلفت الأسطر الأربعة رغم نجاح العودة وحفظ عدد الجوانين والسيتوسين؛ وعند فحص جميع الأزواج نجحت ثلاثة عشر في المكمل الصحيح دون بقية الإجراءات.

بهذا الترتيب نميز ما تسمح به المعلومة وما يحتاج إلى اختبار آخر. العد يصف التركيب، والعودة تختبر خاصية للعملية، وعلاقة المواضع مع المقابلة والأطراف تحدد المكمل المطلوب. لا يتوسع الاستنتاج إلى جين أو عينة أو تشخيص لم نقدم بياناته؛ النتيجة في هذه الورقة تخص سلاسل مؤلفة محددة وقواعد فحص معلنة. هذا الوضوح يجعل نجاح الاختبار قابلًا للفهم وإعادة الحساب.